小兒尿布皮炎是新生兒和嬰幼兒常見的皮膚疾病，臨床表現(xiàn)為臀部發(fā)紅、皮疹、糜爛等，嚴重時會并發(fā)細菌感染而引起全身性感染，對新生兒生命安全造成威脅。小兒尿布皮炎多屬變應性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD），臨床上ACD患者病變部位皮膚會出現(xiàn)增生變厚、紅斑及苔蘚樣變，并伴有瘙癢，屬于典型的Ⅳ型超敏反應。目前國內外用于治療ACD的藥物主要包括糖皮質激素、抗組胺藥及免疫調節(jié)劑等，這些藥物長期外用有導致皮膚萎縮、色素沉著、繼發(fā)感染等副作用，并且停藥后病情易反復發(fā)作，極大降低了患者的生活質量。油茶籽油是油茶籽經過壓榨、浸出等方法制得的木本植物油，具有“油中珍品”的美譽。研究表明，油茶籽油中除較高含量的油酸、亞油酸外，還有多種生理活性物質，如角鯊烯、甾醇、生育酚、茶多酚等，具有防衰老、抗炎、抗腫瘤等多種功能。不同加工方式的油茶籽油中生理活性成分及含量各有差異，用于預防及治療ACD的效果也不同，且目前尚未明確油茶籽油中抗炎的主要有效成分。除油茶籽油外，棉籽油與菜籽油中富含的亞油酸、維生素E、萜烯和酚類物質等也均具有明顯的抗炎作用，民間也有采用二者涂抹皮膚進行消毒愈傷的做法。因此，研究以幼齡小鼠ACD模型為研究對象，以棉籽油與菜籽油作為對照，分析不同加工方式油茶籽油對小鼠耳廓腫脹的緩解效果，并探究主要作用物質，以期為油茶籽油外用治療小兒尿布皮炎提供理論依據(jù)。
油茶果，江西神州通油茶科技有限公司（2020年10月采摘自廬山市）；二級壓榨棉籽油、二級壓榨菜籽油，購買于九江市場。PF級KM小鼠，江西中醫(yī)藥大學動物實驗室。角鯊烯、油酸、亞油酸、生育酚、沒食子酸等均為分析純；2,4-二硝基氟苯（DNFB）、硫化鈉；小鼠TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司。70型雙螺桿壓榨機；DD85G 型單螺桿定點壓榨機；臥式楔子壓榨機，木制自組裝；超臨界流體萃取儀。 油茶籽油的制備油茶果經自然干燥脫殼獲得油茶籽。將油茶籽經150 ℃加熱10 min，通過雙螺桿壓榨機壓榨制油，過0.15 mm（100目）孔徑濾網(wǎng)過濾得到熱榨油茶籽原油；將熱榨油茶籽原油經50 ℃水化脫膠、80 ℃堿液脫酸、活性炭脫色（活性炭添加量為原料質量的0.5%）及0 ℃冬化過夜制備熱榨精煉油茶籽油；采用單螺桿定點壓榨機壓榨油茶籽制油，經過精濾即為低溫壓榨油茶籽油；將油茶籽粉碎后于100 ℃下蒸料20 min，壓制成餅狀后采用臥式楔子壓榨機人工擠壓制油，經過24 h沉淀后取上層清油即為土榨油茶籽油；將油茶籽粉碎后過1.2 mm網(wǎng)孔篩，采用超臨界流體萃取儀在溫度60 ℃、壓力30 MPa、萃取時間1 h條件下制備油茶籽油（以下簡稱“超臨界CO2油茶籽油”）。
1.2.2 動物試驗
預防性給藥組：取6周齡小鼠，正常喂養(yǎng)5 d后隨機分成7組，每組5只。首先采用10%硫化鈉溶液對小鼠腹部脫毛，涂抹60 μL含5%二硝基氟苯的丙酮，用棉簽揉搓吸收。正常喂養(yǎng)4 d后，在小鼠左耳耳廓處涂抹15 μL含5%二硝基氟苯的丙酮進行造模，用棉簽揉搓吸收。1 h后在每組小鼠左耳耳廓相應位置涂抹20 μL不同植物油，用棉簽揉搓吸收，并每隔2 h重復一次，直至給藥8次，右耳不做處理。有效成分組：將造模后給藥組處理中的植物油替換成額外添加50 mg/kg沒食子酸、100 mg/kg角鯊烯和100 mg/kg生育酚的低溫壓榨油茶籽油，以及油酸和亞油酸，其他處理與造模后給藥組一致。 對照組：以正常喂養(yǎng)且不做處理的小鼠作為陰性對照組，造模后不給藥的小鼠作為陽性對照組。試驗完成后，所有試驗小鼠從眼球采血于1 mL離心管中，37 ℃水浴1 h后，5 000 r/min離心10 min，取血清存于-20 ℃冰箱備用。用6 mm打孔器剪下小鼠雙耳給藥對應部位并稱量，隨后放入4%多聚甲醛中進行固定。 1.2.3 小鼠耳廓腫脹率與腫脹抑制率的測定分別按式（1）和式（2）計算小鼠耳廓腫脹率(S)和腫脹抑制率(I)。 式中：m1和m2分別為小鼠打孔左耳廓和打孔右耳廓的質量；S0、S1、S2分別為陰性對照組、陽性對照組和造模后給藥組小鼠耳廓腫脹率。 1.2.4 小鼠血清中TNF-α、IL-6和1L-1β含量測定參照試劑盒說明書采用ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6和1L-1β的含量。 小鼠耳廓腫脹組織病理觀察采用常規(guī)病理切片并用HE染色：將1.2.2固定的耳廓，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察并拍照。 按1.2.5對小鼠耳廓腫脹組織切片后，用過氧化氫處理10 min，再用枸櫞酸液高壓修復 2 min，加入NF-κB一抗冷藏過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后二抗室溫處理15 min，PBS再次清洗后用DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂膠封片后在光學顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J圖像分析軟件測量NF-κB陽性表達區(qū)積分光密度(IOD)，并通過陽性像素面積計算平均光密度。 油酸、亞油酸含量測定參考GB 5009.168—2016中第三法；總酚含量測定參考武利梅的方法；角鯊烯含量測定參考NY/T 3673—2020；生育酚含量測定參考GB 5009.82—2016中第一法。 1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)結果以“平均值±標準差”表示，采用Origin作圖，SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，用Duncan多重比較進行差異顯著性分析。 2.1 不同加工方式油茶籽油對ACD小鼠的抗炎效果 不同加工方式油茶籽油對ACD小鼠耳廓腫脹率和腫脹抑制率的影響如表1所示。 由表1可知，，基于耳廓腫脹程度分析，利用油茶籽油對ACD進行預防效果一般，超臨界CO2油茶籽油能夠顯著抑制ACD小鼠耳廓腫脹。 2.1.2 對炎癥因子、組織病理與NF-κB表達的影響 不同加工方式油茶籽油對ACD小鼠血清中炎癥因子的影響如表2所示。 由表2可知，在預防性給藥組中，預先擦涂超臨界CO2油茶籽油能夠顯著降低TNF-α和IL-6含量，有利于減輕小鼠炎癥。 低溫壓榨油茶籽油因其加工溫度較低，無需精煉，能夠很好地保留營養(yǎng)成分，具有優(yōu)良的抗氧化穩(wěn)定性和貯藏性能。土榨油茶籽油工藝簡單，也不經過精煉。二者在造模后給藥組中效果雖遠不及超臨界CO2油茶籽油，但對小鼠耳廓腫脹有一定的抑制作用（見表1），且能在一定程度上降低炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量(見表2)。因此，考察外用低溫壓榨油茶籽油、土榨油茶籽油和超臨界CO2油茶籽油對ACD小鼠耳廓組織的影響，結果見圖1。 考察外用低溫壓榨油茶籽油、土榨油茶籽油和超臨界CO2油茶籽油對ACD小鼠耳廓腫脹組織NF-κB表達的影響，結果見圖2。 由圖2可知，與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠耳廓組織中NF-κB陽性表達量顯著提升，平均光密度提升了38.78%。3種油茶籽油施藥后，ACD小鼠耳廓組織中NF-κB陽性表達量無顯著變化。與陰性對照組相比，超臨界CO2組的平均光密度增加了12.62%，但無顯著差異。 2.2.1 超臨界CO2油茶籽油與低溫壓榨油茶籽油的主要活性成分 低溫壓榨油茶籽油與超臨界CO2油茶籽油均為低溫制取工藝所得油脂，其活性成分含量較熱榨等方式提取的油茶籽油更高。超臨界CO2油茶籽油與低溫壓榨油茶籽油的主要活性成分見圖3。 由圖3可知，兩種油茶籽油中油酸、總酚與角鯊烯含量無顯著差異，超臨界CO2油茶籽油的亞油酸和生育酚含量顯著高于低溫壓榨油茶籽油。 為了進一步探究油茶籽油中活性成分的抗炎效果，向低溫壓榨油茶籽油中分別添加50 mg/kg沒食子酸、100 mg/kg角鯊烯和100 mg/kg生育酚，同時將油酸和亞油酸（油茶籽油中的主要脂肪酸）外用于ACD小鼠，探究這些活性成分的抗炎效果。油茶籽油中不同活性成分對ACD小鼠耳廓腫脹率和腫脹抑制率的影響見表3。 由表3可知，亞油酸和亞油酸甲酯對巴豆油所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用。 2.2.3 活性成分對炎癥因子、組織病理與NF-κB表達的影響 油茶籽油活性成分對ACD小鼠血清中炎癥因子的影響見表4。 由表4可知，除了角鯊烯組的IL-1β外，這3組中的3種炎癥因子含量均低于低溫壓榨油茶籽油，但高于超臨界CO2油茶籽油（見表2）。 2.2.3.2 組織病理油茶籽油主要活性成分對ACD小鼠耳廓組織的影響見圖4。 由圖4可知，與陽性對照組相比，3組活性成分處理組ACD小鼠的耳廓腫脹均得到了不同程度的改善，角鯊烯組和生育酚組效果更佳，與2.2.2結果類似，這兩組ACD小鼠耳廓組織的腫脹，炎癥細胞浸潤癥狀得到明顯緩解。 油茶籽油主要活性成分對ACD小鼠耳廓腫脹組織NF-κB表達的影響見圖5。 由圖5可知，生育酚組和亞油酸組ACD小鼠耳廓腫脹組織中NF-κB陽性表達量低于陽性對照組，但高于陰性對照組，均無統(tǒng)計學差異，二者平均光密度分別較陰性對照組增加了13.55%和12.64%。角鯊烯組小鼠ACD的耳廓組織中NF-κB陽性表達量顯著低于陽性對照組，與陰性對照組無顯著差異。 不同加工方式油茶籽油中，超臨界CO2油茶籽油緩解ACD小鼠耳廓腫脹效果最佳，實驗表明角鯊烯、生育酚可能是油茶籽油中抗炎的主要作用因子。綜上，外用超臨界CO2油茶籽油治療小鼠ACD效果最佳，超臨界CO2油茶籽油的良好抗炎效果并非源于單一活性成分，而是角鯊烯、生育酚等活性成分的綜合作用結果。以沒食子酸為代表的酚類物質對ACD小鼠抗炎效果作用有限，但不同酚類物質的抗炎效果需進一步確認。
